发布日期：2024-11-19 23:41 点击次数：117
花生是我国进军的油料经济作物性交，亦然一种营养价值很高的食品，晋升花分娩量以及保证花生种子品性是花分娩业发展的进军标的。跟着化学农药的过度使用，诳骗有益微生物晋升着物产量及防治植物病害已成为花分娩业的计划热门[1-3]。植物相干促生菌可通过多种阶梯促进植物健康滋长，如合成吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、固氮、解磷、解钾和按捺植物病原菌滋长等，况且植物相干促生菌对环境友好，因此施用植物促生菌有望成为一种健康而灵验的措施[4-7]。
种子是植物繁育的最主要器官，具有丰富的微生物资源，这些微生物是植物-微生物系统的进军构成要素[8-9]。种子相干微生物种群在种子名义及植物发育经过中具有高度竞争性，可赶紧占据栖息位置及诳骗营养物资，计划种子相干菌群是制定微生物接种剂的关节之一，不错调度植物相干微生物的功能，从而晋升植物的相宜性，对植物健康滋长具有进军真谛[10-12]。Solanki等[13]对小麦籽粒相干菌群分析发现，小麦种子相干微生物不错按捺产毒真菌的生物活性，通过拮抗作用保护植物免受植物病原体的侵害，同期还能灵验减少种子黄曲霉毒素的沾污。Figueiredo等[14]计划发现，种子相干菌可促进玉米种子发芽及植物健康滋长。此外，种子相干菌还不错促进植物在困境下的健康滋长及对重金属等沾污的建造才略[15-16]。种子相干细菌当作种子贮藏及植物早期发育的共生菌，对植物健康滋长具有进军真谛，因此，分离筛选多功能种子相干促生菌可为生物方法晋升着物产量提供救援。现在，种子相干细菌计划基本以种子内生菌为要点，而对种子名义相干细菌计划较少。本计划从花生种子名义、种子里面分离筛选具有促生特质的菌株进行封闭，收用上风菌株考证对花生种子萌生及幼苗的促生才略，以期为微生物菌肥研制提供多功能促生菌株，也为其应用奠定表面基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 花生种子花生种子为花育25，由山东省农业科学院提供。
1.1.2 培养基LB培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基、chrome azurol S assay (CAS)培养基、Ashby无氮固体培养基、无机磷固体培养基、缺钾固体培养基、murashige and skoog (MS)培养基要素均购于青岛海博生物技艺有限公司并按证据书配制。Minimal salts glycerol glautamate (MSgg)培养基参考Hamon等[17]方法配制。
磷酸缓冲液(g/L)：NaCl 8.00，Na2HPO4 1.44，KH2PO4 0.24，KCl 0.20，pH 7.4。
Salkowski比色液：0.5 mol/L FeCl3与35%高氯酸1:50 (体积比)混匀。
1.1.3 主要试剂和仪器基因组索要试剂盒，爱想进生物技艺(杭州)有限公司；高保真团员酶Primes STAR HS DNA Polymerase，宝生物工程(大连)有限公司。
超净责任台，苏州安泰空气技艺有限公司；多功能涡旋混杂器，Scientific Industries公司；恒温培养箱，上海龙跃仪器征战有限公司；恒温摇床，上海一恒科学仪器有限公司；PCR仪，赛默飞世尔科技公司。
1.2 菌株分离 1.2.1 花生种子名义相干细菌分离收用饱胀的花生，在超净台去壳，用无菌水清洗3次后将花生种子浸泡在无菌水中3 h后涡旋30 min，涂布于LB固体培养基，35 ℃培养1 d，字据菌落样式特征的互异，选拔性挑取单菌落划线纯化，直至培养特征有余一致。
1.2.2 花生内生细菌分离花生种子75%乙醇措置30 min后无菌水冲洗5次，再使用10%次氯酸钠浸泡措置10 min后无菌水冲洗5次，取终末漂洗无菌水涂布于LB固体培养基上，35 ℃培养1 d，检测灭菌是否透顶。将消毒后的种子与适量无菌磷酸缓冲液在无菌研钵内研磨，取匀浆上清液涂布于LB固体培养基，35 ℃培养1 d，字据菌落样式特征的互异，选拔性挑取单菌落划线纯化，直至培养特征有余一致。
1.2.3 花生胚根内生细菌分离将消毒后的花生种子置于含无菌水的培养皿中培养4 d，将根与适量无菌磷酸缓冲液在无菌研钵内研磨，取匀浆上清液涂布于LB固体培养基，35 ℃培养1 d，字据菌落样式特征的互异，选拔性挑取单菌落划线纯化，直至培养特征有余一致。
1.3 促生菌促生才略的测定接收Salkowski法测定促生菌IAA合生才略，将菌株接种于LB液体培养基中，其中l-色氨酸浓度为200 mg/L，35 ℃、200 r/min回荡培养4 d，4 ℃、8 000 r/min离心10 min蚁合上清液，取100 μL上清液于酶标板中，加入100 μL Salkowski比色液，昏昧要求下静置30 min测定530 nm吸光度。
定性测定促生菌铁载体合成、固氮、解磷及解钾才略。菌株接种于CAS固体培养基上，35 ℃培养7 d，不雅察是否有橙黄色晕圈出现。菌株接种于Ashby无氮固体培养基上，35 ℃培养3 d，纪录是否有菌落酿成。菌株接种于无机磷固体培养基上，35 ℃培养3 d，不雅察是否有透明圈出现。菌株接种于缺钾固体培养基上，35 ℃培养7 d，不雅察是否有透明圈出现。
超碰在线视频 1.4 植物病原菌滋长按捺考研从实际室前期保存的菌株库里收用4株植物病原菌曲霉菌(Aspergillus sp.)、疫霉菌(Phytophthora sp.)、尖孢镰刀菌(Fusariu oxysporum)和劳尔氏菌(Ralstonia sp.)进行滋长按捺考研。领先将直径0.5 cm的植物病原菌菌饼置于PDA培养基平板中心，30 ℃培养至菌落直径约1 cm，将倡导菌株接种在距离菌丝边际2 cm处，30 ℃持续培养不雅察是否酿成抑菌圈。
1.5 菌株封闭诳骗基因组索要试剂盒索要倡导菌株基因组DNA，诳骗高保真团员酶及引物27F (5′-AGA GTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TAC GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rRNA基因序列，PCR反馈体系及反馈要求按高保真团员酶证据书操作。赢得的序列在EzBioCloud数据库进行BLAST比对分析，收用雷同度高的模式菌株，诳骗MEGA-X软件构建系统发育树(neighbor-joining)。
1.6 生物膜考研倡导促生菌接种于LB液体培养基中35 ℃、200 r/min回荡培养至OD600值约为1.0，菌液4 ℃、8 000 r/min离心10 min后去除上清液，菌体用MSgg培养基洗涤3次并等体积重悬。48孔细胞培养板外围培养孔中加入1 mL无菌水以防护边际效应，中间孔中每孔加入1 mL MSgg培养基及10 μL菌悬液，静置培养48 h后不雅察成膜情况。
1.7 根际定殖考研倡导促生菌接种于LB液体培养基中35 ℃、200 r/min回荡培养至OD600值约为1.0，菌液4 ℃、8 000 r/min离心10 min后去除上清液，菌体用MS培养基洗涤3次并等体积重悬。消毒后的花生种子置于含无菌水的培养皿中催芽3 d，移至无菌蛭石中持续培养4 d，谨防取出用无菌水清洗干净，移栽到含有50 mL 1/2 MS液体培养基的100 mL无菌三角瓶中，22 ℃光照培养箱中静置培养至花生幼苗三复叶一心景况，将准备好的菌悬液按1%接种至MS液体培养基中。22 ℃光照培养箱中持续静置培养3 d，每天补充营养液，保捏三角瓶中液体为50 mL。将花生幼苗在超净台取出，无菌水清洗根表3次，将根置于无菌水中涡旋20 min后超声5 min，菌悬液稀释涂布于LB平板上，35 ℃培养过夜计数。
1.8 种子发芽考研倡导促生菌接种于LB液体培养基中35 ℃、200 r/min回荡培养至OD600值约为1.0，菌液4 ℃、8 000 r/min离心10 min后去除上清液，菌体用无菌水洗涤3次并等体积重悬，消毒后的花生种子在菌悬液中浸泡3 h后在无菌超净台风干，置于含无菌水的培养皿中培养；CK则顺利将消毒后的花生种子置于含无菌水的培养皿中培养。每个措置20粒种子，确立5次重叠，置于25 ℃避光培养4 d筹划发芽率。发芽率(%)=闲居发芽的种子数/总供试种子数×100。
1.9 盆栽考研在无菌蛭石中加入无菌MS营养液后分装至花盆中，每盆约300 g基质，蛭石中间放入一颗消毒后的花生种子。CK为空缺对照，每2天补充20 mL MS营养液；措置组除每2天补充20 mL MS营养液外，每8天补充加入1 mL促生菌菌悬液(参考1.7根际定殖考研中菌悬液制备方法)，30 d后将花生植株从基质中取出，测量植株的苗高、根长、鲜重及干重，每组重叠5次。
2 铁心与分析 2.1 花生种子相干菌株分离及促生才略封闭从花生种子名义、种子里面及胚根共分离纯化到41株细菌，分离编号为PS1‒PS18、PE1‒PE17和PR1‒PR6。定性检测菌株固氮、解磷、解钾及铁载体合成才略，铁心标明，41株菌中仅有6株菌(PS3、PS7、PS8、PR2、PR3和PR6)无法在Ashby无氮固体培养基上酿成单菌落，其余35株菌均有固氮才略。41株菌均未在缺钾固体培养基上出现透明圈，而在无机磷固体培养基上仅菌株PS3及PS5出现较弱透明圈。在CAS固体培养基培养后，仅胚根内生菌PR4及PR5产生了橙黄色晕圈(图 1)。定量检测花生种子相干菌株的IAA合成才略，41株菌均可产IAA，其中合成才略最强的10株菌如图 2所示，而菌株PE16产IAA才略最强，为27.35 mg/L。
2.2 花生种子相干菌株按捺植物病原菌滋长特质诳骗平板维持考研测定花生种子相干菌株对植物病原菌的滋长按捺才略，铁心如表 1所示，有14株菌对曲霉菌、疫霉菌、劳尔氏菌有滋长按捺才略(PS1、PS2、PS3、PS4、PS7、PS8、PS9、PS10、PS11、PE5、PE10、PE15、PR4和PR5)，其中PS2、PS4、PS7、PS8、PS9、PS11和PR5这7株菌对尖孢镰刀菌有明显按捺才略，而菌株PS3、PE5对尖孢镰刀菌拮抗才略较弱。
2.3 菌株16S rRNA基因分析索要41株菌的基因组DNA并进行16S rRNA基因序列扩增测序，将赢得的序列在EzBioCloud数据库进行比对分析，铁心标明，36株为Bacillus sp.，4株为Priestia sp.，1株为Paenibacillus sp.。
从种子名义、种子里面及胚根内赢得的菌株中依据IAA及植物病原菌滋长才略各收用一株菌当作进一步计划对象，分离为菌株PS3、PE5和PR5。通过16S rRNA基因序列比对赢得与倡导菌株雷同性高的16S rRNA基因序列，构建系统发育树如图 3所示。菌株PS3、PR5与Bacillus siamensis KCTC 13613 (AJVF01000043)的16S rRNA基因序列雷同度最高，菌株PE5与Priestia qingshengii G19 (JX293295)的16S rRNA基因序列雷同度最高，雷同度均高于99%。
2.4 促生菌生物膜酿成才略及在花生根部定殖才略促生菌的根际高效定殖是发达作用的前提，与它们酿成生物膜的才略呈正相干，将菌株PS3、PE5及PR5接种至MSgg液体培养基静置培养48 h后不雅察生物膜酿成情况，铁心如图 4所示，3株菌均可在MSgg液体名义酿成生物膜且有褶皱出现，成膜才略较强。进一步对菌株PS3、PE5和PR5在花生根部的定殖才略进行了测试，铁心如图 5所示，标明3株菌均可在花生的根名义灵验定殖，有益于发达其促进植物滋长的才略。
2.5 促生菌对花生种子发芽及幼苗滋长的影响不同促生菌菌液浸种对花生种子发芽的影响如图 6所示，花生种子2 d启动萌生，4 d趋于领略，2 d时，空缺对照发芽率为14.17%，PS5发芽率为38.33%，PE5发芽率为30.83%，PR5发芽率为39.17%，3 d时PS5、PE5和PR5浸种后发芽率也明显高于空缺对照，铁心标明经过促生菌浸种后花生种子萌生率明显晋升。
诳骗盆栽考研测定促生菌对花生幼苗滋长的影响，铁心如图 7所示，相较于空缺措置，PS5对花生幼苗苗高、根长、鲜重和干重分离晋升21.82%、22.20%、37.11%和35.64%，PE5分离晋升17.45%、18.93%、26.10%和21.18%，PR5分离晋升23.11%、23.92%、38.66%和37.47%。本考研铁心标明基质中添加促生菌菌液对花生幼苗有明显促进作用。
3 商议种子是植物生命周期的启动，亦然农业分娩中最基本、最进军的费力，捎带着丰富的微生物资源[6-9]，顺利或迤逦影响着植物的健康滋长，诳骗种子相干促生菌制备微生物菌剂或微生物有机肥，不仅不错晋升着物产量，同期也利于农业的可捏续发展[18-19]。
芽孢杆菌在困境下酿成芽孢，增强了菌株在不良环境中的生涯才略，因此徐徐成为东谈主们平庸计划的一类植物促生微生物。芽孢杆菌可通过多种阶梯促进植物健康成长，一方面不错通过固氮、铁螯合等作用晋升泥土中灵验营养的含量[20-21]；另一方面不错分泌植物类激素，促进植物根系滋长、增多侧根及根毛数目，从而促进植物对营养和水分的摄取[22]；再一方面不错在滋长代谢经过中产生多种具有抑菌活性的次级代谢居品，这些次级代谢居品不仅增强菌株在复杂环境中的竞争才略，同期也能按捺植物病原菌的滋长，保护植物健康滋长[23-24]。本计划从花生种子名义、种子里面及胚根里面分离得到多株促生菌，汇注促生及拮抗才略分离各选一株为代表，经封闭3株均为芽孢杆菌属，在分娩、运输及田间施用时不错酿成抗逆性极强的芽孢样式，具有较高的相宜性[24-27]。
根际定殖一般指倡导微生物在植物根部升值并捏续保管一定种群数目的才略，接种到泥土的植物促生菌在植物根际定殖、存活是其充分发达益生才略的前提，许多计划指出植物促生菌株在其宿主根际的奏凯定殖与其促生成果密切相干[28-30]。植物促生菌在农业分娩中发达进军促生功能的关节门径是芽孢杆菌在植物根际的奏凯定殖，而生物膜的酿成是影响根际定殖的进军因素[31]。生物膜是细菌在多聚糖、卵白质或胞外DNA等基质黏附下汇注于固体、液体介质名义的多细胞汇注体，具有比单细胞景况下更强的环境相宜才略及困境耐受力[32-33]。本计划通过考研计划了3株益生菌在细胞培养板中的生物膜酿成情况，发现PS3、PE5和PR5王人能在MSgg液体培养基中酿成较厚的生物膜，且具有一定的立体结构，定殖考研发现3株菌均可在花生根部灵验定殖。菌株接种到泥土，在植物根际灵验定殖是充分发达促生的基础，本计划波及的倡导菌株生物膜酿成才略强且能灵验地定殖根际，标明具有较好的实质分娩应用后劲。
种子萌生是作物生命周期的启动，发芽率高有益于促进种子在熏陶后快速且汇注萌生，调和且快速的出苗利于农业分娩，也利于作物快速相宜环境尤其是在困境挟制下[34]。种子发芽考研标明，诳骗筛选到的种子相干促生菌浸种后可明显晋升花生种子发芽率；幼苗促生考研也标明，培养基质中添加倡导促生菌可权贵促进花生幼苗的滋长，证据接种倡导植物促生菌后促进植物的早期滋长，利于当代农业的鸿沟化及机械化分娩。
种子相干促生菌可通过多种阶梯促进植物健康成长，而功能各样且高效的促生菌更有实质应用价值。现在植物促生菌在实质应用中仍存在问题，尤其在盆栽考研中发现促生菌在基质中存活时刻短，需要在培养经过中再次添加菌体才调发达促生才略，因此咱们下一步会针对菌体存活时刻短等问题制备复合菌剂概况与生物炭、纳米材料等合作施用，晋升促生菌在泥土中的存活率。
4 论断本计划共赢得41株花生种子相干促生细菌，其中PS3、PE5及PR5经16S rRNA基因序列比对分析封闭为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，具有较强的IAA合成才略及拮抗植物病原菌滋长才略，且能在花生根部灵验定殖性交，并明显促进花生种子萌生及花生幼苗滋长，具有较大的应用后劲，可为生物方法晋升着物产量提供优质菌种资源。
